外泌体中试放大：CCM样本的qEV TFF+qEV220 SEC规模化纯化工作流

摘要： 本文基于IZON Science团队公开海报研究数据，梳理以细胞培养上清（Conditioned Cell Culture Medium，CCM）为代表的复杂生物样本中外泌体/细胞外囊泡规模化纯化工作流。研究通过CCM稀释与澄清、qEV TFF预浓缩和缓冲液置换，再使用qEV220大规格尺寸排阻色谱柱完成蛋白去除，并借助qEV Zenco进行UV在线监测和自动馏分收集。对应研究数据显示，预浓缩CCM在SEC纯化后实现约15倍纯度提升和约96%蛋白去除，多轮自动化运行的洗脱曲线保持较高一致性，为大体积CCM从实验室纯化向中试工艺开发提供方法参考。

关键词：外泌体、细胞外囊泡、细胞培养上清、CCM、SEC、尺寸排阻色谱、TFF、切向流过滤、qEV220、qEV TFF、qEV Zenco、规模化纯化、Exoid

qEV220大规格SEC与qEV TFF切向流过滤组合，主要用于解决大体积、高蛋白和高黏度CCM在EV规模化纯化过程中面临的几个典型工艺问题。IZON Science公开海报数据显示，在对应预浓缩CCM体系中，完成SEC步骤后可获得约15倍纯度提升和约96%蛋白去除，同时qEV Zenco自动化系统在多轮运行中表现出较为一致的洗脱曲线，为外泌体与细胞外囊泡从小规模研究逐步进入中试纯化提供了一种可扩展工作流。相关qEV及EV分析产品和技术资料可参考IZON外泌体与纳米颗粒技术资料。

一、为什么CCM外泌体纯化难度较高

外泌体和细胞外囊泡作为纳米级生物颗粒，在药物递送、疾病标志物以及其他研究方向中持续受到关注。对于细胞来源EV而言，细胞培养上清CCM是常见的生产和研究起始样本之一，但随着上游细胞培养规模扩大，下游纯化需要同时处理数升甚至更大体积液体，因此传统实验室方法很容易受到样本体积、操作时间和处理能力限制。

CCM首先具有“大体积、相对低颗粒浓度”的特点，直接将大量CCM进入SEC柱，会增加上样次数和层析处理时间，因此通常需要先进行预浓缩。其次，CCM中包含培养体系原有组分以及细胞分泌的大量游离蛋白，这些蛋白会显著提高背景，并影响后续颗粒纯度和功能分析。第三，经过浓缩之后的CCM黏度可能进一步提高，如果直接进入SEC，又可能造成流速不稳定、柱床负荷上升和处理重复性下降。

因此，规模化CCM外泌体纯化更适合按照“降低样本处理难度—先浓缩—再精纯”的顺序设计，而不是让某一种分离方法独自完成全部任务。

二、海报研究概览：三种生物基质与一套SEC-TFF工作流

IZON Science公开海报《Translating EV Isolation to Pilot Scale: A Validated SEC-TFF Workflow for High-Purity Processing Across Diverse Biofluids》展示了从qEV10到qEV500等SEC规格，并与qEV TFF切向流过滤组合形成规模化EV处理工作流。研究选用了三种理化性质差异较大的样本，包括脂质和酪蛋白丰富的鲜羊奶、高度浓缩且高黏度的CCM，以及冻存血浆，从而观察同一类SEC-TFF路线在不同生物基质中的应用表现。

针对CCM，主要处理顺序为预处理澄清、qEV TFF浓缩和缓冲液置换，再使用qEV220进行SEC纯化。颗粒浓度通过Exoid可调电阻脉冲传感TRPS进行测定，蛋白浓度使用BCA方法检测，并通过颗粒数量与蛋白量的比值观察纯度变化。

表1：CCM样本SEC-TFF工作流。

图1：CCM样本的qEV220工作流总览。

三、CCM处理流程详解

3.1 预处理：5×稀释、澄清和qEV TFF 10×浓缩

对于高黏度CCM，研究首先进行5×稀释以降低样本黏度，使后续过滤和层析操作更加稳定；稀释后进一步进行澄清，去除细胞碎片和大颗粒聚集物，以降低这些组分对膜和SEC柱床产生的干扰。完成澄清之后，使用qEV TFF进行约10×浓缩，在相对低剪切的动态过滤条件下将大体积CCM缩小到更适合后续qEV220上样的体积，同时完成一定程度的缓冲液置换。

这一阶段的核心任务是浓缩而不是完成最终精纯。TFF能够显著增加单位体积颗粒数量，但部分蛋白也会同步被保留和浓缩，因此获得的是适合进一步进入SEC的高浓度EV进料，而不是最终高纯度产品。

3.2 qEV220 SEC：从EV浓缩液进一步去除游离蛋白

qEV220属于面向更大处理规模设计的SEC柱。海报中的CCM样本采用qEV220 35 nm树脂，原稿同时指出具体树脂孔径可依据目标EV尺寸和纯度需求，在35 nm或70 nm等配置之间进行选择。SEC分离利用EV与更小游离蛋白之间的尺寸差异：EV难以充分进入树脂内部微孔，因此更早通过柱床，而小分子蛋白会进入更多孔隙并产生更长滞留时间，从而使目标EV和大量游离蛋白在洗脱过程中分离。

本研究对应CCM处理规模为5.4 L客户预浓缩样品，纯化后收集液为9.9 L。尽管SEC洗脱导致样本体积增加，但海报最终报告约15倍颗粒/蛋白纯度提升以及约96%的蛋白质去除，因此这一阶段承担的是整个工作流中更主要的深度蛋白去除功能。

3.3 qEV Zenco：将流速、UV监测和馏分收集自动化

随着样本量增加，依靠人工判断SEC流速和馏分收集时间会增加批次差异，因此研究使用qEV Zenco进行自动化层析。该系统集成UV在线监测、流速控制和自动馏分收集，可根据预设运行方法执行多轮SEC，并记录相应洗脱数据。

原稿中关于运行次数存在两处表述，其中一处记录连续运行22次，后续稳健性部分则以20次连续运行作为总结，因此具体数字应以IZON原始海报图表为准。两处描述共同支持的主要信息是，在多轮连续运行中获得的UV洗脱曲线具有较高一致性。

图2：qEV220连续运行多轮UV吸收峰。

四、CCM不同处理步骤中的颗粒、蛋白和纯度变化

海报提供了CCM从Raw粗样品、Clarified澄清后、Post-TFF浓缩后到qEV Purified纯化后的完整颗粒与蛋白数据，可以用来观察每一个工艺步骤对样本组成产生的影响。以下数据按照原稿格式保留：

表2：CCM（qEV220）各处理步骤颗粒浓度、蛋白浓度与纯度变化。数据来源：IZON Science公开海报《Translating EV Isolation to Pilot Scale》。

4.1 TFF阶段主要实现颗粒富集

从Clarified到Post-TFF阶段，颗粒浓度从1.51×10¹2提高至1.81×10¹3 particles/mL，说明TFF对EV进行了明显浓缩；与此同时，蛋白浓度也从14307增加至86619 µg/mL，因此这一阶段的主要功能是降低体积和提高EV浓度，而不是深度去除蛋白。颗粒/蛋白比从1.06×108提高到2.09×108，也进一步说明其纯度改善幅度明显小于后续SEC。

4.2 qEV SEC阶段承担主要蛋白去除功能

完成qEV220 SEC之后，蛋白浓度由86619下降至6000 µg/mL，颗粒/蛋白纯度提升至1.29×10⁹ particles/µg protein。结合海报整体结果，研究报告该流程实现约96%的蛋白去除和约15倍纯度提升，因此SEC是整个工作流中进一步降低游离蛋白背景的关键步骤。

4.3 颗粒浓度降低需要结合SEC洗脱体积理解

qEV纯化后的颗粒浓度为8.68×10¹2 particles/mL，低于Post-TFF阶段的1.81×10¹3 particles/mL，但SEC纯化过程中使用缓冲液进行洗脱，样本总体积也会发生变化，因此不能只根据particles/mL判断总颗粒回收。原稿显示，本次qEV220处理5.4 L预浓缩样本，最终获得9.9 L纯化收集液，因此评价回收表现时还需要结合总体积和总颗粒数量进行计算。

五、自动化与重复运行为什么是中试SEC的重要指标

对于规模化EV工艺而言，一次得到理想纯度并不足以证明流程稳定，因为真正的中试和生产流程需要连续处理多个批次。如果柱床状态、流速或者馏分收集位置在不同运行之间持续漂移，就会导致EV回收率、蛋白残留和最终样品组成产生差异。

qEV Zenco的价值就在于把SEC过程中的关键机械操作自动化，使流速、UV信号记录和馏分收集按照统一程序执行。海报展示的多轮UV洗脱曲线具有较高一致性，可以作为进一步进行柱使用周期、重复运行、工艺可追溯性和自动化条件开发的参考。

同时需要区分“多轮稳定运行”和正式工艺验证。真正进入更规范的生产体系后，仍需要围绕柱寿命、清洗和再生、回收率、残留杂质、EV身份、质量属性以及批间一致性等建立更完整的数据。因此，这项研究更适合被理解为中试放大和标准化工艺开发的技术案例，而不是直接等同于完整GMP验证。

六、SEC-TFF联用对CCM规模化纯化的主要启示

从IZON公开海报可以看到，TFF和SEC在复杂CCM纯化中承担不同功能。TFF解决大体积和颗粒稀释问题，通过浓缩和换液把CCM转换成适合层析处理的进料；SEC则进一步解决高蛋白背景问题，通过尺寸排阻机制将EV与大量游离蛋白和较小杂质分开。对于高黏度样本，在两者之前加入稀释和澄清步骤，可以进一步提高后续工艺稳定性。

自动化则解决第三个问题，也就是重复运行中的人为差异。当qEV220与qEV Zenco组合后，可以通过UV监测、稳定流速和自动馏分收集提高多批次运行的一致性。与此同时，从qEV10到qEV220及更大规格的同类SEC体系也提供了在相同基本分离原理下逐步扩大处理体积的思路。

因此，对于CCM来源EV而言，规模化下游工艺更适合被理解为一套连续流程，而不是寻找一种单独“万能纯化方法”。实际项目仍需根据上游培养规模、CCM黏度、蛋白含量、EV粒径和最终纯度要求，对预处理、TFF膜、浓缩倍数、SEC规格和收集区间进行重新优化。

关于IZON Science相关技术体系

IZON Science的EV相关技术体系覆盖qEV尺寸排阻色谱柱、qEV TFF切向流过滤、qEV Zenco等自动化纯化设备，以及Exoid TRPS纳米颗粒分析平台，可用于从EV分离纯化到颗粒浓度和粒径分析的不同实验环节。对于正在从小体积EV研究向更大规模CCM工艺开发推进的团队，可以将TFF、SEC、自动化层析和颗粒分析放在同一工作流中进行评价，而不是将各步骤完全割裂。

参考文献

拓展阅读

IZON qEV、TFF及纳米颗粒分析技术资料

IZON外泌体与纳米颗粒纯化表征技术专栏

关于技术来源

本文基于IZON Science公开海报《Translating EV Isolation to Pilot Scale》及相关SEC、TFF和颗粒分析技术资料，曼博生物MineBio整理，仅用于科研信息分享、实验参考和CCM来源EV规模化纯化方法理解。文中颗粒浓度、蛋白浓度、约15倍纯度提升、约96%蛋白去除以及5×稀释、10× TFF浓缩等参数均来源于对应研究样本和实验体系，不构成对其他样本或项目的固定性能结论。实际应用仍需结合细胞培养上清组成、EV粒径、样本黏度、膜MWCO、SEC树脂、进样量、流速、馏分区间、颗粒回收和最终质量要求进行验证。 本文围绕IZON Science、qEV220、qEV TFF、qEV Zenco、Exoid TRPS、SEC-TFF、CCM、外泌体中试放大和EV规模化纯化等方向整理相关公开技术信息。