增强子研究必备：荧光素酶报告系统实验全流程解析

增强子（enhancer）是基因组上一类能够增强目标基因转录活性的顺式调控元件，不依赖自身位置、方向，它通过结合特异性转录因子及共调控因子，显著增强靶基因的转录起始效率，提升 mRNA 转录水平。

增强子的主要特点 

1.位置不固定

增强子可位于靶基因的上游、下游、基因内含子区域或远端基因间区域。

2.无方向性

将增强子反向插入载体中通常仍可保持增强转录的功能。

3.细胞/组织特异性

不同细胞/组织具有不同的增强子活性，增强子可在特定发育阶段或生理状态下被激活，从而实现基因表达的精确调控。

4.结合转录因子

增强子通过结合特异性转录因子、共激活因子及染色质重塑复合物发挥调控作用。

5.染色质开放

活性增强子通常位于开放染色质区域，并富集H3K27ac、H3K4me1等活性增强子相关组蛋白修饰。

6.序列变异敏感性

增强子区域的遗传变异（如SNP、突变或结构变异）可能影响转录因子结合和增强子活性，进而改变靶基因表达并参与疾病发生。

增强子的作用机制

增强子、启动子与基因主体协同转录模式示意图（Panigrahi A et al., 2021）

01 转录因子结合增强子

增强子区域含有特定的转录因子结合位点，当特定转录因子在细胞/组织表达时，会识别并结合增强子DNA序列。

02 招募共激活因子并促进染色质开放

结合增强子的转录因子能够招募组蛋白修饰酶和染色质重塑复合物，使转录调控复合物更容易结合。

03 形成增强子-启动子染色质环

活化的增强子通过三维基因组结构与目标基因启动子发生空间接触，将调控信号传递至转录起始区域。

04 促进转录起始复合物形成

增强子-启动子互作促进基础转录因子和RNA聚合酶Ⅱ在启动子区域的募集与组装，提高转录起始效率，从而增强目标基因表达。

荧光素酶报告基因实验验证增强子功能

荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是验证候选增强子是否具有转录增强活性以及分析转录因子或SNP对增强子功能影响的经典方法。其基本原理是：将候选增强子序列克隆至荧光素酶报告载体中，通过检测荧光素酶活性的变化，评价该增强子对基因转录的调控能力。

01 质粒构建

（1）增强子质粒构建

利用生物信息学工具和数据库，如ENCODE、UCSC Genome Browser、Ensembl等，可以通过输入基因名称或染色体位置来查找增强子序列。

单独的增强子元件不具备启动基因表达的功能，需要与启动子共同作用来提升启动子活性，从而促进基因的表达。因此检测增强子活性需要特殊的荧光素酶报告基因载体，例如pGL3-Promoter，pGL4.23等，它们均带有一个弱启动子，在启动子上游有一个多克隆位点（MCS），可以用来插入待验证的增强子序列。

（2）转录因子质粒构建

利用生物信息学工具和数据库，如JASPAR、ChIP-Atlas、ENCODE ChIP-seq等，可以通过输入染色体位置或增强子序列来查找可能的转录因子。

在NCBI中查找特定转录因子的CDS序列，插入pcDNA3.1(+)中。

02 荧光素酶报告基因实验

（1）细胞培养：增强子具有细胞特异性，优先选择与研究对象相关的细胞系。

（2） 细胞铺板：细胞种于12孔板中，种板密度为第二天转染前细胞密度达到60-70%左右。

（3）质粒转染：细胞转染前1小时更换不含双抗的完全培养基，采用Lipo3000转染试剂，根据研究目的按如下体系转染：

（4）转染48h后按荧光素酶报告基因实验试剂盒进行操作。

（5）多功能酶标仪检测，根据测定数据计算结果。

参考文献

Panigrahi A, O'Malley BW. Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown. Genome Biol. 2021 Apr 15;22(1):108.